ELISA檢測如何做到結果無瑕?關鍵在于細節與技巧

　　ELISA，即酶聯免疫吸附測定，是免疫學中的常用技術。想在ELISA檢測中得出結果，需要注意以下幾點：首先，樣本預處理要合適，不同類型的樣本如血清、血漿、尿液等，預處理方法各異，需嚴格遵守操作規程。其次，實驗器材和試劑需優質，ELISA試劑盒的選擇至關重要，使用前需檢查有效期及試劑是否澄清足量。實驗過程中，正確的加樣、孵育、洗滌和顯色步驟，每一步都需嚴格控制時間和溫度，避免交叉污染。最后，比色時需保證酶標板底部干燥、干凈，使用酶標儀準確測量光密度值。遵循這些步驟，ELISA檢測的結果將更加準確可靠。

　　以下是實現ELISA檢測結果的關鍵操作要點，分步驟系統優化：

　　一、實驗前準備

　　試劑與儀器校準‌

　　移液槍需定期校準(誤差<2%)，推薦使用20μl/100μl/1000μl多規格移液槍組合

　　酶標儀預熱30分鐘，雙波長檢測(主/參比波長：450nm/630nm)

　　樣本處理‌

　　血清樣本需56℃ 30分鐘滅活補體，離心3000×g 10分鐘去除顆粒物

　　樣本稀釋液需與標準品基質一致(如含1% BSA的PBS)

　　二、核心步驟優化

　　包被與封閉‌

　　高結合力聚苯乙烯板包被抗原時，需覆蓋孔底全部表面(避免過量導致層間剝離)

　　封閉液優選5% BSA(非脂奶粉可能引起交叉反應)，封閉時間延長至1-2小時

　　加樣與孵育‌

　　加樣順序：標準品從低濃度到高濃度平行加入，避免槍頭交叉污染

　　37℃孵育時需覆膜密封，濕度控制60%以上防止邊緣孔蒸發

　　洗滌控制‌

　　含0.05% Tween-20的PBS洗滌液，每孔注液量≥350μl

　　手動洗滌需傾斜45°甩板3次，自動洗板機吸液高度距孔底0.5-1mm

　　三、質量控制

　　標準曲線驗證‌

　　R²值需>0.99，CV值<10%，回收率90%-110%

　　臨界值樣本需重復檢測3次，避免假陽性/陰性

　　背景干擾排除‌

　　高背景時可添加0.1% Triton X-100或提高鹽濃度(PBS+0.5M NaCl)

　　非特異結合嚴重時改用間接法或夾心法(靈敏度提升3倍)

　　四、故障處理速查

　　問題現象 解決方案

　　信號弱 檢查酶標二抗活性，延長底物反應時間(不超過15分鐘)

　　孔間差異大 棄用邊緣2圈孔，僅使用中間60孔檢測

　　標準曲線異常 更換新鮮標準品，確保梯度稀釋準確

　　(注：全程需設置空白孔/陰性對照孔，環境溫度波動需<1℃)

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