如何預防ELISA實驗樣本處理錯誤?

　　一、樣本采集與保存規范

　　抗凝劑選擇與處理?

　　使用EDTA抗凝血漿時需立即顛倒混勻5-8次，避免局部凝血?。

　　避免使用肝素鈉(可能干擾抗原-抗體結合)或含疊氮鈉的保存液(抑制HRP酶活性)?。

　　保存條件優化?

　　短期檢測(≤7天)樣本可4℃保存，長期需分裝后-80℃凍存，避免反復凍融(>3次)導致蛋白降解?。

　　組織樣本需加入蛋白酶抑制劑(如PMSF)后勻漿，分裝保存?。

　　二、樣本預處理關鍵步驟

　　離心參數標準化?

　　血清/血漿需3000×g離心20分鐘，4℃操作，確保去除細胞碎片?。

　　尿液/腦脊液需高速離心(10000×g)或0.22 μm濾膜過濾去除顆粒物?。

　　稀釋與干擾控制?

　　高濃度樣本需預實驗確定稀釋倍數(如1:5至1:20)，避免“鉤狀效應"?。

　　溶血樣本需超濾處理或稀釋，避免血紅蛋白干擾顯色?。

　　三、操作流程防錯措施

　　加樣與污染預防?

　　使用帶濾芯槍頭，每孔更換吸頭，避免交叉污染?。

　　冷藏樣本需室溫平衡30分鐘后再加樣，確保反應均一性?。

　　洗滌與封閉規范?

　　洗滌液需注滿孔內(避免殘留)，重復5-6次，每次靜置30秒?。

　　封閉液推薦5% BSA或脫脂牛奶，孵育≥30分鐘以減少非特異性結合?。

　　四、質控與驗證

　　對照設置?

　　每批次實驗需包含空白孔、陰性對照(健康樣本)及陽性對照(標準品)?。

　　回收率試驗：向樣本中添加已知濃度標準品，驗證檢測效率?。

　　儀器校準?

　　定期校準移液器(如5-10 μL小體積加樣)和酶標儀波長(如TMB底物450nm)?。

　　五、常見問題快速排查

　　顯色淡/靈敏度低?：檢查抗體效價、樣本是否反復凍融或酶標物失活?。

　　高背景信號?：確認封閉充分、底物避光保存且孵育時間≤15分鐘?。

　　注：以上僅供參考，不作為實際數據，實驗需嚴格遵循說明或咨詢技術老師。

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