能詳細說說酶聯(lián)免疫吸附法的步驟嗎?

　　酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是一種常用的免疫學(xué)檢測技術(shù)，其核心步驟包括樣本處理、加樣、溫育、洗滌、顯色和結(jié)果測定等環(huán)節(jié)?。以下是基于常見雙抗體夾心法的詳細操作流程：

　　1. ?試劑準(zhǔn)備與樣本處理?

　　標(biāo)準(zhǔn)品溶解?：將凍干標(biāo)準(zhǔn)品加入1mL通用稀釋液，靜置15分鐘溶解后，按說明書進行倍比稀釋，配置梯度濃度工作液?。

　　樣本稀釋?：根據(jù)樣本類型(如血清、細胞上清)進行適當(dāng)稀釋(如10倍稀釋：取20μL樣本加180μL稀釋液)?。

　　2. ?加樣與溫育?

　　加樣?：從平衡至室溫的鋁箔袋中取出酶標(biāo)板，每孔加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品或稀釋后的樣本，空白孔加稀釋液?。

　　初次溫育?：蓋上封板膜，37℃孵育60-90分鐘，使抗原與固相抗體結(jié)合?。

　　3. ?洗滌與檢測?

　　洗滌?：棄去液體后，每孔加入300μL洗滌液，靜置1分鐘，重復(fù)洗滌3-5次以去除未結(jié)合物質(zhì)?。

　　加檢測抗體?：每孔加入100μL生物素化檢測抗體，37℃孵育60分鐘?。

　　加酶結(jié)合物?：洗滌后加入酶結(jié)合物(如ABC工作液)，37℃反應(yīng)30分鐘?。

　　4. ?顯色與結(jié)果測定?

　　顯色?：每孔加入90μL TMB底物，37℃避光反應(yīng)15分鐘?。

　　終止與讀數(shù)?：加入50-100μL終止液終止反應(yīng)，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測定吸光度(OD值)?。

　　關(guān)鍵注意事項

　　樣本保存?：血液樣本需分離血清，2-8℃保存不超過7日，長期保存需-20℃以下。

　　溫育控制?：建議采用水浴或濕盒孵育，確保溫度均勻。

　　洗滌質(zhì)量?：洗滌需津，避免殘留液體影響結(jié)果。

　　ELISA的靈敏度可達ng/mL~pg/mL水平，廣泛用于抗原、抗體及小分子檢測?。不同方法(如間接法、競爭法)步驟略有差異，需根據(jù)實驗?zāi)康恼{(diào)整?。

　　注：以上僅供參考，不作為實際數(shù)據(jù)，實驗需嚴(yán)格遵循說明或咨詢技術(shù)老師。

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